유산균 발효 황금 추출물의 황산화 활성

본 연구에서 사용한 황금은 시중에서 황금분말을 구입하여 −20°C에서 보관하며 사용하였다. 황금 추출물 제조는 황금 원물을 분말시료 30 g에 증류수 300 mL를 가하여 환류냉각추출(reflux extraction, RE)을 이용하여 80°C에서 3시간 동안 추출하였다. 추출물은 200 mesh로 여과한 후 여과지(advantec No.2, Toyo Roshi Kaisha, LTD., Japan)로 감압여과하고 회전 감압 농축기(N-1000, Eyela, Japan)를 사용하여 농축하며 −80°C에서 냉각 후 동결건조기(FD8508, Ilshinbiobase Co., Korea)를 이용하여 동결건조하여 분말 상태로 −80°C에서 보관하면서 시료로 사용하였다. 이후 분말을 증류수에 2%로 희석하여 시료로 사용하였다.

사용한 유산균으로는 한국교통대학교 식품생명학부에서 분양받은 Leuconostoc mesenteroides MGE3138(L.m), Lactobacillus plantarun MGE3143(L.pl), Lactobacillus paracasei MGE3016 (L.pa) 균주를 사용하였으며, 백금이로 각각 한 집락 채취해 MRS Broth(Difco Co., USA) 배지에 1차 접종 후 37°C, 24시간 배양 후, 10 mL MRS Broth에 다시 1%를 2차 접종 후 37°C, 24시간 증균배양을 실시하였다. 황금추출물에 유산균 배양액을 각각 2%씩 접종하고 37°C, 72시간 발효를 진행하였다. 이는 항산화 활성이 발효 3일에 가장 큰 활성을 가진다는 Lim의 연구(12)에 따라 발효하였다. 발효 후 autoclave로 121°C, 15분 열을 가하여 유산균의 실활을 유도하였으며, 동결건조기(FD8508, ilshin biobased, Korea)로 동결건조해 분말화 하여 −80°C에 보관하면서 시료로 사용하였다.

pH 측정은 pH meter(FP20, METTLER TOLEDO, Greifensee, Switzerland)를 이용하여 발효를 진행하는 3일 동안 Homogenizer(MS-HS320, IKA, USA)로 1,300 rpm에서 5분간 균질화하여, 3회 반복 측정하였다.

총 폴리페놀 함량은 Kim 등의 방법(13)을 일부 변형하여 측정하였다. 시료 4 mL에 0.2 N Folin-Ciocalteu’s phenol reagent 시약(Sigma-Aldrich, USA)을 4 mL, 2 % Na₂CO₃ 용액 4 mL를 가하고 실온 암소에서 1시간 반응시켰다. 반응 후 spectrophotometer(Optizen POP, Mecasys Co., Korea)를 이용하여 750 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다. 대조구는 gallic acid(Sigma-Aldrich, USA)를 농도별로 희석하고, 표준곡선을 작성하여 시료 중의 총 폴리페놀 함량을 정량하여 gallic acid equivalents(mg GAE/g)로 환산하여 나타냈다.

총 플라보노이드 함량은 Lee 등의 방법(14)을 이용하여 측정하였다. 시료 5 mL에 5% sodium nitrite 0.75 mL를 혼합하여 실온에서 6분간 반응시킨 후 10% aluminium chloride 1.5 mL를 첨가하고, 실온에서 5분간 반응시킨 다음 1 N NaOH 5 mL와 혼합한 후 spectrophotometer를 이용하여 510 nm에서 흡광도를 측정하였다. 총 플라보노이드 함량은 (+)- catechin hydrate(Sigma-Aldrich, USA)를 농도별로 희석하고, 표준곡선을 작성하여 catechin equivalents(mg CE/g)로 환산하여 나타냈다.

DPPH(2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl)에 대한 radical 소거능은 DPPH의 환원력을 이용하여 측정하였다(15). 즉 시료 1 mL에 0.2 mM DPPH 용액(99.9 % ethyl alcohol) 용해 후 9 mL를 가하고 10초간 혼합한 후 실온암소에서 10분간 반응시키고, spectrophotometer를 이용하여 517 mm 파장에서 흡광도를 측정하였다. 이때 전자공여능은 시료 첨가군과 시료 무첨가군의 흡광도 차이를 백분율(%)로 구하였다.

모든 실험은 3회 이상을 반복 실험을 시행하였으며, 얻어진 결과는 SPSS(Statistical package for the social science 18.0) program을 사용하여 Duncan’s multiple range test를 실시하였다. 통계적 유의성 검증은 p<0.05 수준에서 유의적 차이를 확인하였다.

황금 추출물의 유산균 발효에 따른 pH 변화는 Table 1에 나타내었다. 본 실험의 결과 L. mesenteroides, L. plantarum, L. paracasei 3종류의 발효 추출물 모두 시간이 지남에 따라 pH가 점차적으로 감소하는 것을 확인하였다. 그 중 Lactobacillus paracasei 발효 추출물의 경우, 0시간 5.76±0.01, 24시간 4.08±0.01, 48시간 3.80±0.01, 72시간 3.84±0.00으로 가장 큰 감소 폭을 보였으나 배양 48시간 이후로는 큰 변화를 보이지 않았다. 이러한 pH 변화의 원인은 미생물이 당을 이용해 유기산을 생성하고, 효소 가수 분해에 의한 아미노산, 펩타이드, 유리지방산 등의 증가로 인한 수소이온농도가 증가하는 것으로 보고된 바 있다(16). 또한 황금 발효 추출물의 pH가 감소하는 결과는 Bae(17) 등의 연구와 유사한 경향을 나타내었다.

유산균 발효에 따른 황금 추출물의 총 폴리페놀 함량은 Figure 1에 나타내었다. 페놀성 화합물은 항산화 작용을 하여 체내 조직을 보호할 뿐만 아니라 생리적 효율성을 높임으로써 페놀 화합물의 함량이 많을수록 항산화 활성이 높다고 알려져 있다(18). 유산균에 따른 발효물의 총 폴리페놀 함량은 L. paracasei 발효 황금 추출물이 38.57±0.87 mg GAE/g으로 가장 높았으며 L. plantarum 37.64±0.92 mg GAE/g, L. mesenteroides 34.02±0.16 mg GAE/g 순으로 나타났다. 비발효 황금 추출물과 비교하여 유산균 발효 황금 추출물의 경우 유의적으로 높은 총 폴리페놀 함량을 나타내었는데, Kim 등(19)의 기존 연구에 따르면 미생물에 의한 생물전환을 통해 총 폴리페놀 함량 변화에 영향을 줄 수 있다고 한다. 따라서 발효한 황금 추출물의 총 플라보노이드 함량의 증가 원인은 L. mesenteroides, L. plantarum, L. paracasei의 대사과정을 통해 이루어졌을 것으로 판단된다.

Figure 1. Total polyphenol content of fermented Scutellaria baicalensis extraction. ^a-c superscripts are significantly different at p<0.05 by Duncan’s multiple range test.

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유산균 발효에 따른 황금 추출물의 총 플라보노이드 함량은 Figure 2에 나타내었다. 비발효 황금 추출물의 경우 21.49±0.81 mg CE/g을 보였으며, L. paracasei은 33.21±5.62 mg CE/g, L. plantarum 30.99±1.28 mg CE/g, L. mesenteroides 25.87±0.22 mg CE/g으로 나타났다. 총 플라보노이드 함량 또한 유산균 발효 황금 추출물에서 유의적으로 높은 함량을 나타내었으며, 폴페놀 함량과 유사한 결과를 보였다. 플라보이드는 폴리페놀의 일종이며, 폴리페놀 함량이 증가하면 항산화 등과 같은 생리활성 또한 비례적으로 증가한다고 보고되고 있다(20). 본 실험결과는 이전 연구에서 L. mesenteroides를 이용한 사물탕 발효물의 총 폴리페놀 및 플라보노이드 함량이 발효에 따라 증가하는 결과와 유사한 경향을 보이는 것을 확인하였다(21).

Figure 2. Total flavonoid content of fermented Scutellaria baicalensis extraction. ^a-c superscripts are significantly different at p<0.05 by Duncan’s multiple range test.

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유산균 발효에 따른 황금 추출물의 DPPH radical 소거능은 Figure 3에 나타내었다. DPPH radical 소거능은 L. paracasei은 67.83±0.37%, L. mesenteroides 56.06±0.10%, L. plantarum 52.40±0.51%, non-fermented 45.30±0.54% 순으로 나타났다. L. paracasei은 67.83±0.37% 발효 황금 추출물이 다른 발효물에 비해 유의적으로 높은 DPPH radical 소거능을 보였는데, 이는 기존 Maisuthisakul 등(22)의 연구에 따르면 폴리페놀 및 플라보노이드 화합물은 불안정한 라디칼에 전자를 공여함으로써 라디칼을 소거한다고 한다. 따라서 페놀성 화합물과 Radical 소거능과 높은 상관관계를 지녀 다음과 같은 결과를 나타낸 것으로 보여진다. 또한, DPPH radical 소거능을 Shin(23)의 미더덕 껍질, 뽕잎, 양파의 추출물을 함유한 발효소스 제조 실험 결과와 비교하였을 때 높은 DPPH radical 소거능을 지니고 있으므로 활용 가능성이 높다고 보여진다.

Figure 3. DPPH scavenging activity of fermented Scutellaria baicalensis extraction. ^a-c superscripts are significantly different at p<0.05 by Duncan’s multiple range test.

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